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技术资料 恺佧学堂

CD3抗原,你了解多少?

2020.06.11

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  OKT3,双特异抗体和CD3抗原


全球治疗性抗体的历史上,OKT3是具有里程碑式影响力的抗体,是第一个上市的治疗性抗体,开创了单克隆抗体治疗疾病的先河。虽然由于OKT3是全鼠源,存在强烈的免疫原性,治疗效果大幅下降,OKT3后因引起类似细胞因子风暴的过敏反应等原因退市,OKT3抗体作为检测试剂结合免疫细胞表面的CD3抗原来标记T细胞,OKT3抗体能有效刺激CD3+T细胞,在肿瘤免疫抑制和激活方面的研究,依旧在科研和药物研发界有着广泛的应用。如果说OKT3在抗体药物研发界如同明星般广为人知,OKT3的靶点CD3抗原就如同明星的配偶般只知道其存在,而不会被特别留意。

随着双/多特异抗体和肿瘤免疫药物研发兴盛,CD3抗体再一次回到抗体药物研发人员的视野,在临床阶段的双特异抗体中,有接近一半的双抗其中一个靶点是CD3抗原。已有相当多的文献报道,双特异抗体要发挥其最佳的抗肿瘤活性,需要协调好双抗CD3抗体这端和CD3抗原的亲和1,双抗中CD3抗体这端与CD3抗原的亲和力太强,会过度的激活人体的免疫T细胞导致细胞因子释放综合征(CRS),有安全性风险,而CD3抗体这端与CD3抗原的亲和力太弱,则无法在肿瘤细胞部位募集T细胞导致双抗效果不明显,一般来说双抗一端的CD3抗体和CD3抗原的亲和力在10nM-100nM范围内,会有较好的治疗窗口,双抗有最佳的体内药效。

当抗体药物研发不再是找一个跟抗原有强结合的抗体,而是有合适亲和力的抗体如双特异抗体的CD3抗体,免疫激动剂CD137抗体或者更安全的CART CD19抗体时,抗体和抗原互作亲和力的准确定量将变得极为重要,是药物安全性和疗效的关键属性参数。皮之不存,毛将焉附, 抗体亲和力准确定量的前提是有一个经过充分活性验证的抗原,此篇文章将会系统的梳理CD3抗原的活性验证过程,探讨一个经充分调研和活性验证抗原在抗体药物研发的重要性和必要性。


CD3抗原


CD3为在T细胞上发现的一次跨膜蛋白,有四种亚型即CD3D, CD3E, CD3G 和 CD3Z, 其CD3D/CD3E, CD3G/ CD3E为异源二聚的形式和TCR的α链和β链形成TCR-CD3复合物。抗原呈递细胞(APC)呈递的特异性MHC多肽复合物能够和TCR-CD3复合物,诱导T细胞的激活。当抗体药物研发讲到靶向CD3时,严格意义上讲指代的是靶向Human的CD3E抗原,Unprot ID: P07766,当我们讲到CD3E时,我们不得不谈到CD3D, CD3E,因为在生理条件下T细胞上的CD3抗原的形式是CD3D/CD3E, CD3G/ CD3E异源二聚体,关于CD3E的此特性是极为重要,由于蛋白的柔韧性,其作为单价态存在时和其处于与其他蛋白互作(同源二聚/异源二聚)时空间结构是否有变化是有待考察的。


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     CD3E抗原的性质表征

      

一般来讲抗原质量的关键参数由两方面构成,纯度和活性。纯度由HPLC,还原和非还原的SDS-Page表征,本文主要从蛋白纯度和蛋白水平的活性验证两方面来对CD3E抗原进行讨论。

首先CD3异源二聚体两个亚基分子量十分接近,在共表达时容易形成同源二聚体,恺佧生物采用特殊的设计,确保异源二聚体能够精确表达,在纯化过程中,通过不同纯化方法的优化,进一步确保异源二聚体两个亚基的等比例表达。


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抗原蛋白活性水平的测定一般会选择其天然的配体或者针对该抗原有多篇文献报道的知名的抗体进行活性验证,测定抗原和配体/抗体的亲和力数据,测定方法可以是SPR/BLI,ELISA或者流式,一般来说通过ELISA和流式测定的EC50值在实验条件恰当是等同于亲和力数值KD的。具体到CD3E抗原,由于CD3E形成的TCR复合物的复杂性寻找合适的配体进行活性验证比较困难,此篇文章选取了CD3E的SP34和临床抗体Foralumab进行活性验证。

对于CD3 异源二聚体活性的验证,恺佧生物做了靶向CD3E的临床抗体Foralumab,Foralumab针对CD3E/CD3G的亲和力数据在8nM级别,但是其针对CD3E/CD3D的亲和力在0.1nM级别。而且Foralumab针对CD3E 单体未能得到很好的ELISA 曲线。同一个抗体针对不同的CD3E异源二聚体有十分悬殊的亲和力数据,足以说明CD3E抗原以异源二聚存在时,其构象发生了明显的改变,特别是针对CD3E结合位点的位置。虽然目前市面上的CD3 的抗体是针对CD3E的,但也主要是识别CD3E 在异源二聚体中的构象表位,需要有另一个亚基去确保整个构象的正确和抗体的正确识别。


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在OKT3 抗体上,我们也得到了类似的结果,两个抗体对于CD3E 单体均未有很好的亲和力。同时,我们针对批次间的稳定性进行了验证,结果表明恺佧的CD3E异源二聚体具有高度的批间稳定性。


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根据文献1报道,T细胞的CD3D和CD3G的基因水平只有2-3三倍的差异,在真实的生理条件下,Foralumab对T细胞的亲和力可能会表现为Foralumab与CD3E/CD3D 0.1nM级别的亲和力,其安全性风险会急剧增加。在临床实验过程中Foraluma并未采用静脉注射而采用口服和鼻腔给药可能是对Foralumab与CD3E/CD3D强亲和力的妥协。Foralumab的案例折射了在药物研发过程中研发人员更加期待的是预期的数据(Foralumab与CD3E/CD3G 亲和力10nM)而不是更全面的数据(Foralumab与CD3E/CD3D 亲和力0.1nM)可能导致后期研发风险进一步加大的严重后果。在CD3抗体发现的过程中更全面的数据要比想要的数据更为重要。

  恺佧生物蛋白研究院还进行了知名CD3抗体SP34对各个CD3抗原的亲和力的测定。SP34区别于前面两种抗体,可以同时识别各类种属的CD3E ,并且在亲和力上没有表现出差异性。这暗示着SP34识别的是CD3E的非空间结构的线性表位,这个结果也提醒各位客户,在进行CD3 异源二聚体的活性评价时,SP34 抗体不是一个好的选择,不能真实的反映二聚体的构象表位是否正确。


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  结果讨论:

 

在双特异抗体药物研发过程中,出于CD3抗原的结构复杂性和CD3抗原存在模式的多样性,不同的抗体表征CD3抗原的结果也会大不一样,需要做到完全的表征才能有效的为后期的药物研发起到指导作用。

  从恺佧生物蛋白研究院关于CD3抗原的研究可以看出,在双特异抗体药物研发过程中,发现一个合适的CD3E抗体,CD3抗原的选择、评价和组合显得十分重要。如果细究CD3E抗体的专利2,采用CD3E单价态抗原,CD3E/CD3D抗原, CD3E / CD3G抗原分别进行杂交瘤免疫,或者同时采用Cynomolgus CD3E/CD3G, Cynomolgus CD3E/CD3D同时进行免疫来同时对获得Cynomolgus/Human CD3E有合适亲和力的抗体3。但对于不用的免疫动物,可根据相应情况制定不同的免疫策略,有时也可以选择亲和力相对较高的CD3D&CD3E 进行免疫。


恺佧生物提供完全活性表征的CD3E系列产品助力双特异抗体药物研发,产品详情如下:


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参考文献:

1.Chen S , Yang L , Lu X , et al. Gene expression profiling of CD3gamma, delta, epsilon, and zeta chains in CD4(+) and CD8(+) T cells from human umbilical cord blood.[J]. Hematology, 2010, 15(4):230-235.

2. WO2019045856

3. WO2015181098A1